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聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液的研制與分析

聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液的研制與分析
發布人:真人百家家乐网址凈水      發布時間:19-01-18       瀏覽次數:
聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質。它在樣品介質和聚丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后,蛋白質亞基的點泳遷移率主要取決于亞及分子量的大小,而電荷因素可以被忽略。當蛋白質的分子量在15KD到200KD之間時,電泳遷移率與分子量的對數呈線性關系,可以用來測定蛋白質亞基的分子量。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺(CH2=CHCONH2 Acrylamide)和甲叉雙丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N’-methylenebisacrylamide)聚合而成,這一聚合過程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有兩種:化學聚合和光聚合。化學聚合通常是加入催化劑過硫酸銨(AP)以及加速劑四甲基乙二胺(TEMED),四甲基乙二胺催化過硫酸銨產生自由基:以R·代表自由基,M代表丙烯酰胺單體,這樣由于乙烯基”CH2=CH-”一個接一個的聚合作用就形成丙烯酰胺長鏈,同時甲叉雙丙烯酰胺在不斷延長的丙烯酰胺鏈間形成甲叉鍵交聯,從而形成交聯的三維網狀結構。氧氣對自由基有清除作用,所以通常凝膠溶液聚合前要進行抽氣。丙烯酰胺的另一種聚合方法是光聚合,催化劑是核黃素,核黃素在光照下能夠產生自由基,催化聚合反應。一般光照2-3小時即可完成聚合反應。
聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質最初是在玻璃管中進行的,玻璃管通常直徑為7 mm,長10 cm,將凝膠裝入到多個管中進行電泳,又稱為柱狀電泳。目前仍有應用,尤其用于二維電泳中的第一維電泳。但由于各個玻璃管的不同以及裝膠時的差異使每管的分離條件會有所差異,所以對各管樣品進行比較時可能會出現較大誤差。后來發展起來的垂直平板電泳一次最多可以容納20個樣品,電泳過程中樣品所處的條件比較一致,樣品間可以進行更好的比較,重復性也更好,所以垂直平板電泳目前應用的更為廣泛,常用于蛋白質及DNA序列分析過程中DNA片段的分離、鑒定。
水平平板電泳近年來也有很快的發展,與垂直平板電泳相比也有其獨特的優點:①由于凝膠可以直接鋪在冷卻板上,容易使凝膠冷卻,因而可以加高電壓以提高分辨率。②電泳速度快,通常只要1小時左右,而園盤電泳和垂直平板電泳一般需要3~4小時。③因為可以使用薄膠,加樣少,染色快,從而提高了靈敏度,而且容易保存,只要用甘油浸泡后自然干燥即可長期保存不會龜裂。④便于適用各種電泳方式,用途廣泛,尤其是可以使用90年代才發展起來的只有水平電泳系統才能使用的新的半干技術,即用浸有少量緩沖液的半干的膠條代替通常所用的大量電極緩沖液,大大節約了試劑,簡化了操作,提高了電泳速度。
聚丙烯酰胺凝膠的孔徑可以通過改變丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度來控制,丙烯酰胺的濃度可以在3%-30%之間。低濃度的凝膠具有較大的孔徑,如3%的聚丙烯酰胺凝膠對蛋白質沒有明顯的阻礙作用,可用于平板等電聚焦或SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠,也可以用于分離DNA;高濃度凝膠具有較小的孔徑,對蛋白質有分子篩的作用,可以用于根據蛋白質的分子量進行分離的電泳中,如10%-20%的凝膠常用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠的強度、彈性、透明度、粘度和孔徑大小均取決于兩個重要參數T和C,T是丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺兩個單體的總百分濃度。C是與T有關的交聯百分濃度。T與C的計算公式是: C = 6.5-0.3T
上式中a為丙烯酰胺的克數,b為甲叉雙丙烯酰胺的克數,m為水或緩沖液體積(ml)。式中a與b的比例很重要。富有彈性,且完全透明的凝膠,a與b的重量比應在30左右。選擇T和C的經驗公式是: C = 6.5-0.3T此式可用于計算T為5%~20%時的凝膠組成。C值并不很嚴格,在大多數情況下,可變化的范圍約為 ±1%,當C保持恒定時,凝膠的有效孔徑隨著T的增加而減小,當T保持恒定,C為4%時,有效孔徑最小,C大于或小于4%時,有效孔徑均變大,C大于5%時凝膠變脆,不宜使用,實驗中最常用的C是2.6%和3%。
操作流程:
1.安裝灌膠模具,依照說明書進行
2.按照配方配置一定量(7cm模具配置1mm厚的膠配置5ml)的分離膠溶液和濃縮膠溶液(2ml),過硫酸銨和TEMED在用前加入。
3.分離膠溶液充分混勻后從一側加入灌膠模具,上方留約1.5-2cm用于加濃縮膠,小心的在分離膠的表面加一層水飽和正丁醇(或水飽和的異丙醇、水),封住膠面,以促使聚合并保持膠面平整。
4.室溫放置40分鐘到1小時后,可以看到一個界面,去掉上層覆蓋液,用濃縮膠緩沖液淋洗膠面,然后灌制濃縮膠,并插入與模具大小相同,凝膠厚度相當的梳子。
5.靜止放置40-60分鐘使凝膠聚合,電泳液清洗樣品孔。
6.制備好的蛋白質樣品用2Xloading buffer 1:1混合,與分子量marker 一起100℃煮3-5min, 12000rpm離心5-10min,(7cm模具、1mm厚度、10孔、考染上樣量30ug)
7.加入下槽液,把夾有凝膠的玻板轉移到電泳槽,加入上槽液,上樣。
8.連接電源,5-10mA/膠開始電泳,待溴酚藍前沿到達分離膠后加大電流到10-15mA/膠,
9.溴酚藍前沿到達玻璃板底部時停止電泳,取出凝膠,做好標記,準備染色。
10.染色。見考馬斯亮藍染色操作規程及銀染色操作規程。
11.掃描。掃描操作見掃描儀的使用說明。
由于聚丙烯酰胺凝膠有突出的優點,因而四十年來得到廣泛的應用,目前尚無更好的支持介質能夠取代它。其主要的優點有:①可以隨意控制膠濃度”T”和交聯度”C”,從而得到不同的有效孔徑,用于分離不同分子量的生物大分子。②能把分子篩作用和電荷效應結合在同一方法中,達到更高的靈敏度:10-9 ~10-12 mol/L。③由于聚丙烯酰胺凝膠是由-C-C-鍵結合的酰胺多聚物,側鏈只有不活潑的酰胺基-CO-NH2 ,沒有帶電的其他離子基團,化學惰性好,電泳時不會產生”電滲”。④由于可以制得高純度的單體原料,因而電泳分離的重復性好。⑤透明度好,便于照相和復印。機械強度好,有彈性,不易碎,便于操作和保存。⑥無紫外吸收,不染色就可以用于紫外波長的凝膠掃描作定量分析。⑦還可以用作固定化酶的惰性載體。
注意事項
1.在加過硫酸銨和TEMED之前溶液最好抽氣,防止溶解在溶液里的分子氧在聚合時產生氣泡使膠不均一。
2.過硫酸銨和TEMED的量應根據室溫和聚合情況而定。
3.分離膠聚合后最好在4℃放置12小時后再使用,以使凝膠充分聚合,改善電泳時的分辨率。
4.為防止氣泡陷入,梳子應傾斜插入。
5.如果帶著梳子過夜可能會影響分辨率,所以濃縮膠最好在使用前再灌制。
6.如果沒有足夠數目的樣品,應在加樣孔中加樣品緩沖液,不要留有空孔,以防止電泳時鄰近的帶擴展。
7.對樣品濃度不確定的情況下,加樣時使用梯度加樣法,能大致估計出樣品的濃度。
配成30%的丙烯酰胺水溶液在4℃下能保存1個月,在貯存期間丙烯酰胺會水解為丙烯酸而增加電泳時的電內滲現象并減慢電泳的遷移率。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是一種對中樞神經系統有毒的試劑,操作時要避免直接接觸皮膚,但它們聚合后則無毒。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷,它們的分離是依據其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用,因而可以得到較高的分辨率,尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質和酶等生物大分子的生物活性,對于生物大分子的鑒定有重要意義,其方法是在凝膠上進行兩份相同樣品的電泳,電泳后將凝膠切成兩半,一半用于活性染色,對某個特定的生物大分子進行鑒定,另一半用于所有樣品的染色,以分析樣品中各種生物大分子的種類和含量。

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